Zellviabilität: So wird sie richtig gemessen

Erfahren Sie in diesem Beitrag alles rund um das Thema Zellviabilität. Was sagt die Zellviabilität aus? Welche Methoden gibt es zur Messung? Wir liefern die Antworten.

Was versteht man unter Zellviabilität?

Bei der Zellviabilität handelt es sich um ein wissenschaftliches Maß, welches den Anteil lebender Zellen in einer Zellpopulation angibt. Dabei wird die Viabilität als Prozent der lebenden Zellen im Verhältnis zur Gesamtheit aller toter und lebendiger Zellen in der Probe angegeben. Je höher die prozentuale Viabilität, desto mehr lebendige Zellen befinden sich in der gesamten Probe.

Warum wird die Viabilität gemessen?

Die Bestimmung der Zellviabilität ist eine wichtige und häufig durchgeführte Methode im Labor, die mehreren Zwecken dienen kann. Insbesondere bei der Medikamentenentwicklung verwendet man häufig Viabilitätsassays, um den Einfluss eines Wirkstoffs auf unterschiedlichen Zellen, wie zum Beispiel Krebszellen, zu evaluieren.

Zum anderen bildet die Messung der Viabilität die Grundlage vieler Experimente. Dann erfolgt die Messung der Viabilität vor der Aussaat der Zellen in einem Kulturgefäß. Auf diese Weise kann vor der Aussaat bestimmt werden, wie viele der Zellen ausgesät werden sollen, damit das Zellkulturgefäß zu einem bestimmten Zeitpunkt, die gewünschte Zelldichte aufweist und anschließend für weiterführende Experimente verwendet werden kann.

Wann wird die Viabilität gemessen?

Die Viabilität wird zudem vor und nach einer Kryokonservierung gemessen. Dadurch wird überprüft, ob die Zellen nach dem Einfrieren und wieder Auftauen so lebensfähig sind, wie zuvor und weiter verwendet werden können. Zellen verändern sich im Laufe der Kultivierung. Mit jeder Passage können sich die Proliferationsrate, das Expressionsmuster oder auch der Phänotyp der Zellen verändern. Daher sollte eine Zelllinie nicht unnötig lange kultiviert werden, wenn sie nicht gerade in Gebrauch ist. Hierbei eignet sich die Kryokonservierung der Zellen bei einer frühen Passagenzahl. Dies erlaubt nicht nur eine Lagerfähigkeit sondern auch eine Transportfähigkeit der Zellen.

Eine solche Langzeitlagerung erfolgt entweder in der Gasphase von flüssigem Stickstoff oder in der Flüssigphase. In beiden Fällen werden die Zellen bei Temperaturen unterhalb von minus 120°C eingefroren, wodurch jegliche biochemischen Reaktionen in den Zellen gestoppt werden. Werden die Zellen wieder benötigt, setzen sie nach dem Auftauen, ihre Stoffwechselaktivitäten in Gang, leben weiter und können wieder für Versuche genutzt werden.

Welche Methoden gibt es?

Ein ideales Viabilitätsassay sollte reproduzierbar, effizient sowie zeit- und kosteneffektiv sein und nicht mit der Testsubstanz interferieren. Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Bestimmung der Viabilität, die auf verschiedene Funktionen von Zellen beruhen:

• Enzymaktivität
• Zellmembranpermeabilität
• ATP-Produktion
• Co-Enzym Produktion

Die Eigenschaft, dass die Zellmembran bei toten Zellen permeabel ist, macht sich die Trypanblau-Methode zur Bestimmung der Viabilität zu Nutze. Der Farbstoff dringt in toten Zellen ein und bindet an zytosolische Proteine. Weiterhin gibt es Farbstoffe, wie beispielsweise Neutralrot, die lebendige Zellen anfärben. Nach der Färbung müssen die markierten Zellen noch gezählt werden. Das geht manuell durch den Blick unter ein Hellfeldmikroskop oder automatisiert mithilfe von speziell für diesen Zweck hergestellten Laborgeräten.

Kolorimetrische Verfahren zur Bestimmung der Viabilität basieren auf der Überprüfung der metabolischen Aktivität von Zellen.

 

Ein Assay, der auf der Überprüfung der metabolischen Aktivität der Zellen beruht, ist das MTT-Assay. Der Test beruht auf der Umwandlung von MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ) in Formazan-Kristalle durch lebende Zellen, was die mitochondriale Funktion anzeigt. Nach Lyse der Zellen kann diese Farbveränderung mittels eines Spektralphotometers quantifiziert werden.

Bei der Lebend-Tot-Färbung werden sowohl lebende als auch tote Zellen angefärbt. Verwendet werden dafür zwei verschiedene Farbstoffe. Dabei färbt einer die lebenden Zellen, während der andere Farbstoff die Toten färbt.

Die genannten Methoden haben alle gemeinsam, dass es der Zugabe einer weiteren Substanz, wie zum Beispiel eines Farbstoffs bedarf, anhand welcher die Viabilität bestimmt werden kann.

Einige Farbstoffe, wie Trypanblau, haben den Nachteil, dass sie zytotoxisch wirken. Dies kann die Ergebnisse verfälschen, da sich im Verlauf der Zeit immer mehr tote Zellen in der gemessenen Probe befinden.

Kann man die Viabilität auch ohne Verwendung eines Farbstoffs messen?

Ebenfalls besteht die Möglichkeit die Zellviabilität zu messen, ohne der Probe zusätzliche Substanzen, die oftmals zytotoxisch wirken können, zuzuführen.

Als eine innovative Methode gilt die holografische Mikroskopie, die auf der hochmodernen Phasenbildtechnik beruht. Mit ihrer Hilfe werden die morphologischen und strukturellen Unterschiede jeder Zelle mittels eines neuronalen Netzwerks binnen weniger Sekunden untersucht. Danach wird automatisiert die Lebensfähigkeit der Zellen ermittelt und angegeben.

Da die holografische Mikroskopie keine weiteren Zusätze wie Farben benötigt, entfällt der Schritt der Zellfärbung bei dieser Methode zu Gunsten von Zeitersparnissen im Workflow. Außerdem werden so ungewollte Reaktionen von zytotoxischen Farbstoffen wie beispielsweise Trypanblau vermieden, die mitunter zu einem verfrühten Zelltod führen können und so im schlimmsten Fall die Ergebnisse der Studie beeinflussen.

Weitere Informationen

Der handliche fluidlab R-300 von anvajo basiert auf der innovativen Technologie der Holographie und bestimmt auch ohne Zusätze die Zellviabilität.

Die oben aufgeführte Abbildung stellt Ausschnitte eines Bildes dar, welches nach der Zählung von HeLa Zellen mit dem fluidlab R-300 erhalten wurden. Die digitale holographische Mikroskopie-Technik hebt die morphologischen und strukturellen Veränderungen hervor, die während des Zelltods auftreten. Qualitativ zeichnen sich lebende Zellen durch eine dunkle Kontur, die der intakten Zellmembran ähnelt, und ein helles, strukturiertes Zytoplasma aus. Tote Zellen hingegen erscheinen zunächst als dunkle Objekte, die später durch Prozesse wie Membranfragmentierung, den Kontrast und eine klar definierte Begrenzung verlieren.

Dieser Beitrag entstand mit freundlicher Unterstützung von der Firma anvajo.

Quellen:

Stoddart, M. Cell viability assays: introduction. Methods Mol Biol. 2011; 740:1-6.

Kamiloglu, S et al, Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 2020; 1(3): 332-349

Tawakoli PN et al, Comparison of different live/dead stainings for detection and quantification of adherent microorganisms in the initial oral biofilm. Clin Oral Investig. 2013

Cell Signaling Technology: Synopsis of Cell Proliferation, Metabolic Status, and Cell Death https://www.cellsignal.com/science-resources/cell-viability-and-survival#:~:text=Cell%20viability%20is%20a%20measure,as%20during%20a%20drug%20screen. [18.03.2021]

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