Optimale Probenvorbereitung biologischer Materialien

Die optimale Probenvorbereitung biologischer Materialien ist das A und O für eine erfolgreiche Analyse. Biologische Proben unterscheiden sich dabei zum Teil grundlegend in Formen und Konsistenzen voneinander. So kann es sich bei dem biologischen Ausgangsmaterial beispielsweise um harte Knochen oder zähe, faserige Pflanzen handeln, genauso gut aber auch um zähes Sputum oder weiches Lebergewebe.

Ziel jeder Probenvorbereitung ist die Überführung des Ausgangsmaterials in eine der jeweiligen Analysemethode zugängliche Form. Je nach Probe kommen dabei zunächst unterschiedliche Aufschlusstechniken zum Einsatz. Vorher müssen Proben jeglicher Art homogenisiert und pulverisiert werden. Der Aufschluss von Zellen wie Hefen, Bakterien oder Algen zur Isolation von DNA / RNA oder zur Proteinextraktion erfolgt über Bead Beating oder kryogenen Zellaufschluss. Anschließend erfolgen die Homogenisierung und Pulverisierung der Probe.

Zellaufschluss, Homogenisierung und kryogene Pulverisierung lassen sich allesamt mithilfe von Labormühlen durchführen. Wir erklären, wo die Geräte Sie ideal beim Prozess der Probenvorbereitung unterstützen.

Zellaufschluss von Hefe oder Mikroalgen in Suspension

Der Zellaufschluss von Bakterien, Hefe, Fadenpilzen oder auch Mikroalgen ist ein Standardverfahren. Ziel aller Zellaufschlusstechniken ist die Zerstörung der Zellmembran – entweder mithilfe von Chemikalien oder mechanischen Kräften. In diesem Fall geht es darum an Nukleinsäuren, Zellproteine oder Metabolite zu gelangen.

Eine mögliche Methode ist das sogenannte Bead Beating. Bei dieser äußerst effektiven Methoden kommen Glaskügelchen zum Einsatz. Genauer gesagt brechen Scherkräfte zwischen den Kugeln die Zellwände beim Schütteln auf. Bead Beating wird häufig in 2 ml Einweg-Reaktionsgefäßen oder im größeren Maßstab in 50 ml Falcon® Tubes durchgeführt. Beim einfachsten Verfahren kommt ein Vortexer zum Einsatz. Allerdings ist diese Vortex-Variante mitunter sehr zeitaufwändig und auch fehleranfällig. Ganz besonders bei hohem Probendurchsatz oder bei Aufschlusszeiten von bis zu 10 Minuten.

Zellaufschluss mit der Schwingmühe

Durch den Einsatz von Mühlen, die mit unterschiedlichen Adaptern betrieben werden können, wird der Zellaufschluss wesentlich schneller, effizient und reproduzierbar. Die RETSCH Schwingmühle MM 400, wie die untere Abbildung zeigt, ist ein solches System. Durch das automatische Aufbrechen der Zellen gewinnt der Anwender wertvolle Zeit, die er für andere Laboraufgaben nutzen kann.

Die MM 400 eignet sich hervorragend für den Zellaufschluss in Einweg-Reaktionsgefäßen, aber auch für die Homogenisierung einer große Vielfalt von Materialien. Die Mühle kommt sowohl bei harten, mittelharten, spröden, weichen, elastischen oder faserigen Probenmaterialien zum Einsatz. Gängige Proben sind beispielsweise Pflanzen, Kiefernnadeln, Federn, Knochen und Zellgewebe.

Die Durchführung des Zellaufschlusses zur Isolierung von DNA oder RNA erfolgt üblicherweise in 2 ml Reaktionsgefäßen, da letztlich weniger als 1 ml Zellmaterial notwendig ist. In der Mühle lassen sich bis zu 20 Proben in einem Arbeitsgang gleichzeitig homogenisieren. Für die Extraktion von Proteinen oder Metaboliten werden jedoch größere Mengen an Zellsuspension benötigt; hierfür sind 50 ml Zentrifugenröhrchen (Falcon® Tubes) geeignet. In der MM 400 lassen sich 8 Proben à 30 ml Zellsuspension simultan aufbereiten.

Fallbeispiel: Zellaufschluss von Saccharomyces cerevisiae

Das automatisierte Verfahren mit der MM 400, in Kombination mit dem Adapter für 8 x 50 ml Zentrifugenröhrchen, bietet viele Vorteile gegenüber dem manuellen Vortexen. So dauerte das Vortexen von 20 g Hefesuspension und 16 g Glaskügelchen 12 x 1 Minuten. Inklusive einer Minute Zwischenkühlung auf Eis. Der simultane Aufschluss von mehr als 2 Proben gleichzeitig ist von einer Person nicht zu bewältigen.

Der Einsatz der Schwingmühle vereinfacht die Laborarbeit deutlich, da der gleichzeitige Aufschluss von bis zu 8 Proben bei 30 Hz erfolgt und das automatisch. Dadurch reduziert sich die benötigte Zeit auf 7 Minuten und zusätzlich ist der Proteinertrag deutlich erhöht (Abb. 2).

Weitere Vorteile der automatisierten Methode sind der geringe Temperaturanstieg in der Zellsuspension sowie die bessere Reproduzierbarkeit. Dies verdeutlichen die  beiden nachfolgenden Abbildungen.

Fallbeispiel: Zellaufschluss von Mikroalgen

Der Zellaufschluss von Mikroalgen ist häufig eine besondere Herausforderung, da die Zellen den Schereffekten der Glaskugeln eher widerstehen. Mit der MM 400 lassen sich Mikroalgen jedoch erfolgreich aufschließen.

Im Beispiel wurden 300 ml Zellsuspension des Organismus Thalassiosira pseudonana zentrifugiert, in 20 ml Pufferlösung suspendiert und anschließend in ein 50 ml Falcon® Tube gefüllt. 40 ml Glaskügelchen (90 – 400 µm) wurden hinzugefügt und der Zellaufschluss wurde für 20 Sekunden bei 20 Hz durchgeführt. Durch das Mikroskop lässt sich der vollständige Zellaufschluss erkennen, wie Abbildung 5 und 6 verdeutlichen.

2. Homogenisierung von biologischen Proben wie Sputum oder Leber

Ein Adapter für die MM 400 fasst 5 x 5 ml Einweggefäße. In diesen lässt sich auch zähes, möglicherweise infektiöses, Sputum von Patienten mit zystischer Fibrose leicht in einem Arbeitsschritt homogenisieren. Dies hat unter anderem den Vorteil, dass potenzielle Gesundheitsrisiken minimiert werden.

Die Schwingmühle homogenisiert bis zu 3 ml Sputum mit 3 Kugeln (Ø 5 mm) bei 30 Hz für 2,5 min. Die kurzen Prozesszeiten machen den Einsatz der MM 400 vor allem bei der täglichen Abarbeitung vieler Proben sehr vorteilhaft.

Auch die Homogenisierung von Proben wie beispielsweise Lunge, Leber oder Tumorgewebe, ist in 5 ml Tubes problemlos möglich. So beispielsweise etwa 3 g frische Leber mit 3 x 10 mm Stahlkugeln in 5 min bei 30 Hz. Dabei ist das Röhrchen fast komplett mit Puffer aufgefüllt.

Größere Probenmengen bis 15 g werden im Zentrifugalröhrchen 3 min bei 30 Hz homogenisiert. Pro Gefäß sind dafür 4 Stahlkugeln (20 mm) und Puffer bis zur maximalen Befüllungslinie notwendig.

3. Kryogene Vermahlung von Zellpellets, Muskelgewebe oder Kiefernnadeln

Bei der kryogenen Vermahlung kommt flüssiger Stickstoff zum Verspröden der Probe zum Einsatz. Diese Art der Pulverisierung bietet sich unter anderen für weiche oder zähe Proben  an. Beispielsweise wenn kein Puffer eingesetzt werden darf oder eine Trocknung der Probe ausgeschlossen ist.

Kryogene Vermahlung in der Schwingmühle MM 400 oder der CryoMill (siehe auch Abbildung 7) ist vor allem sehr effektiv für Proben, wie beispielsweise faserige Pflanzen, klebrige Beeren oder widerstandsfähige Gewebe wie Rattendarm. Beim kryogenen Zellaufschluss werden sogar intrazelluläre Strukturen aufgebrochen, außerdem kommen sämtliche zelluläre Aktivitäten beim Einfrieren zum sofortigen Stopp, Abbaureaktionen, z. B. von Proteinen werden so minimiert.

Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die Probenmaterialien, bei denen die MM 400 oder auch der CryoMill erfolgreich zum Einsatz kamen.

Probe	Zubehör	Probenmenge	Zeit	Frequenz	Endfeinheit
Muskelgewebe	50 ml Mahlbecher aus rostfreiem Stahl, 1 x 25 mm Mahlkugel aus rostfreiem Stahl	10 g	4 min	25 Hz	< 150 µm
Kiefernnadeln	20 x 2 ml Reaktionsgefäße in 2 Adaptern für je 10 Reaktionsgefäße, 2 x 5 mm Mahlkugeln aus rostfreiem Stahl pro Gefäß	2 Nadeln pro Gefäß	3 min	30 Hz	Reproduzierbare RNA Extraktion von 20 Proben in einem Schritt
Klebrige Beeren	50 ml Mahlbecher aus rostfreiem Stahl, 4 x 15 mm Mahlkugeln aus rostfreiem Stahl	2 g	40 sec	20 Hz	200 µm
Rattendarm	35 ml Mahlbecher aus rostfreiem Stahl, 1 x 20 mm Mahlkugel aus rostfreiem Stahl	1,8 g	2 min	30 Hz	150 µm

4. Pulverisierung von Knochen und Haaren

Die Pulverisierung forensischer Proben erfolgt häufig in zwei Schritten. Dabei erfolgt zunächst eine Vorzerkleinerung in einer Schneidmühle, wie beispielsweise der SM 300, die auch frisches Knochenmaterial mit Fleischresten verarbeiten kann. Verschiedene Rotoren und Siebe lassen eine optimale Anpassung an das jeweilige Probenmaterial zu.

In dem Anwendungsbeispiel wurden 700 g Knochen in der SM 300 mittels 6-Scheibenrotor und 6 mm Bodensieb bei 3000 min^-1 in nur 30 Sekunden auf 6 mm Partikel vorzerkleinert (Abb. 10).

Die vollständige Homogenisierung der Proben erfolgt abschließend meist in einer Kugelmühle mit Mahlkugeln > 5 mm. 1 g der vorzerkleinerten Knochen wird z. B. im 35 ml Mahlbecher Zirkoniumoxid mit einer Mahlkugel 20 mm bei 30 Hz in der MM 400 in 2 min auf 200 µm Partikel zerkleinert. 1 g Haare werden am besten mit 6 Mahlkugeln à 10 mm Durchmesser für 2 min bei 25 Hz pulverisiert.

Die pulverisierten Proben können dann nach Abschluss des Prozesses zur Drogenanalytik oder DNA Extraktion verwendet werden.

Fazit

Vom „Bead Beating“ für den Zellaufschluss über die Pulverisierung und Homogenisierung bis hin zur Kryogenvermahlung – Labormühlen bieten zuverlässige und komfortable Lösungen für die Probenvorbereitung in Bereichen wie Biotechnologie, Diagnostik, Forensik, Mikrobiologie und Agrarwissenschaften.

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